Restriktioentsyymejä ovat entsyymit, jotka leikkaavat sekä yksin- että kaksoisjuosteista DNA: ta. Jokaisella restriktioentsyymillä on spesifinen nukleotidisekvenssi, jota kutsutaan restriktioalueeksi, joka tunnistaa ja leikkaa. Restriktioentsyymejä käytetään DNA-sekvensointiin, mutaatioanalyysiin ja DNA: n kloonaamiseen ja amplifikaatioon. Tutkijat käyttävät restriktioentsyymejä kiinnostavien geenien lisäämiseksi ilmentämisvektoreihin, DNA-molekyyleille, jotka voivat replikoida erikseen kromosomaalisesta DNA: sta. Vastetta, joka sisältää mielenkiinnon kohteena olevan geenin, voidaan sitten viedä bakteerikantaan proteiinien ilmentämiseksi ja karakterisoimiseksi.
Päivän video
Vaihe 1
Määrittele vektoriesi restriktioentsyymikohdat tarkastelemalla rajoituskarttaa. Rajoituskartassa kerrotaan, mitkä entsyymit leikkaavat vektoriasi ja missä.
Vaihe 2
Valitse restriktioentsyymi, jolla on myös geenisisällön läsnä oleva kohta, tarkastelemalla REPLACEin sekvenssiä. Varmista, että restriktiokohta on sellaisen REPLACEin kohdalla, joka on kiinnostavan geenin ulkopuolella, joten et menetä mitään osaa geenistä.
Vaihe 3
Varmista, että rajoitussivustolla ei ole kaksoiskappaleita missään geenisisällössä tai vektorilla. Tämä aiheuttaa useita leikkauksia DNA: ssa ja antaa sinulle harhaanjohtavia tietoja.
Vaihe 4
Yritä valita rajoittavia entsyymejä, jotka leikataan tahmeilla päädyillä, eivät tylpät. Kiinnitettävät päät syntyvät, kun entsyymi katkaisee kaksijuosteisen DNA: n porrastetusti jättäen yksisäikeisen ulokkeen, joka helpottaa kiinnittymistä vastakkaisella tavalla leikattuna. Blunt-päitä esiintyy, kun kaksisäikeinen DNA leikataan sileästi ja näitä on vaikeampi kiinnittää.
Vaihe 5
Valitse eri restriktioentsyymi REPLACEin molemmille päille varmistaaksesi, että se asetetaan vektoriin oikeaan suuntaan ja varmista, että vektori ei liity itselleen uudelleen.
Vaihe 6
Yritä valita kaksi restriktioentsyymiä, jotka toimivat hyvin samassa puskurijärjestelmässä ja lämpötilassa. Jos tämä ei ole mahdollista, suorita jokaisen ruoansulatuksen erikseen.
tarvittavat asiat
- geenisisällön sekvenssi
- valintavektorin restriktiokartta
- restriktioentsyymien ja niiden leikkauspisteiden luettelo
vinkkejä
- Joitakin web-ohjelmia on kehitetty tunnistamaan DNA-sekvenssin restriktiokohtia nopeasti. Yksi tällainen ohjelma on New England BioLabs.
